Heat Labile – Salt Active Nuclease

HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶

                                                                                 HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶

描述

       无论是实验室规模样品制备、还是生产规模工艺过程,去除核酸都可以改善工艺流程,如蛋白纯化、病毒载体制备、mNGS中样品处理等过程。而核酸酶的选择,就显得特别重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (热不稳定性耐高盐核酸酶,HL-SAN) 是一种非特异性内切酶,在高盐浓度下具有最佳活性;且该酶在多种缓冲液中都有活性,很容易通过还原剂处理而失活。这些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的应用中,更为适合。

       核酸污染,特别是宿主基因组DNA污染,在几乎所有工艺流程及生物制品的生产中,都是需要重点解决的问题。一方面,宿主DNA的存在,影响目标产物的纯化及下游质量分析等。另一方面,宿主DNA残留能引起机体严重的免疫反应,是生物制品的关键质量参数之一,FDA及NMPA等对Host Cell DNA (HCD)有严格的质控要求。宿主基因组DNA中,组蛋白与DNA形成核小体,核小体紧密折叠形成结构复杂的染色质。组蛋白与DNA间存在强烈的离子作用及疏水作用,再加上特殊的结构,导致宿主DNA很难被准确检测并清除。已有文献表明,高盐浓度下组蛋白与DNA解离相对彻底,这有利于宿主DNA的检测及去除。但市售的绝大多数核酸酶在高盐浓度下活性很弱,甚至完全失活。而耐高盐的HL-SAN成了这类应用的理想选择。


HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶




高盐浓度能够提高去除效率


HL-SAN是一种新型的、耐高盐的工程化内切酶。该酶在0.5 M NaCl条件下具有最佳活性,是去除宿主DNA污染的理想选择。

盐浓度是去除过程的重要参数之一。高盐浓度下,宿主DNA与蛋白质能够完全解离,从而更容易被降解。








推荐应用

1.   病原微生物检测应用,如宏基因组测序(mNGS)样品去除宿主DNA;

2.   蛋白纯化,特别是DNA结合蛋白;

3.   病毒载体制备,如腺相关病毒(AAV)、腺病毒(AdV)等;

4.     其他需要去除宿主DNA的应用等。


优势

1.   高盐条件下,DNA清除效率更高,宿主DNA残留更少;

2.     pI为9.6,容易跟绝大多数蛋白分离;

3.     还原剂存在时,酶易失活,减少对后续流程的影响。

 

使用指导

1. DNA去除方案

       从细胞抽提物或细胞裂解液中去除DNA污染,HL-SAN的使用量受到多种因素影响,如细胞类型、裂解液组成、NaCl浓度、Mg2+浓度、裂解液pH等。参考方案见Figure 1。比如,对于1ml细胞裂解样品,调整到0.3-0.75 M NaCl浓度,加入1000 U HL-SAN,15℃-37℃温度条件下孵育30-60min,或者4℃过夜。Mg2+是必须的。

HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶

Figure 1. 不同样品、不同去除要求下,HL-SAN的推荐浓度及反应条件。(DNA removal的要求是指通过琼脂糖凝胶电泳看不到条带,Decontamination的去除要求是对23S rDNA进行qPCR检测为阴性)


2. 灭活

  灭活是通过添加还原剂(TCEP或DTT)来实现的,推荐用TCEP(因为TCEP在磷酸盐溶液中不稳定,特别在中性pH下)。不同工艺流程中,通过改变孵育时间、温度和还原剂的浓度等来灭活该酶。一般情况下, 25-37℃反应5-10分钟,可以灭活99%以上的酶。为了避免酶恢复活性、再次激活,保持低浓度还原剂,如0.1-0.5 mM DTT或TCEP,或延长灭活反应时间。

灭活条件(温度/时间)

DTT

TCEP

4℃/18 hr

/

10 mM

25℃/60 minutes

10 mM

5 mM

30℃/30 minutes

10 mM

5 mM

40℃/30 minutes

5 mM

1 mM

50-70℃/30 minutes

1 mM

1 mM

Figure 2. HL-SAN的灭活反应条件。


3. 去除

       HL-SAN的pI是9.6,能够紧密结合阳离子交换柱。在pH 9.0条件下用0.2M盐冲洗,柱子的流出液/废液中只有不到0.02%酶脱落。需要注意的是,不推荐使用阴离子交换柱去除HL-SAN,因为HL-SAN的糖基化修饰会结合到柱子上。

HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶

Figure 3. HL-SAN紧密结合在SP-sepharose柱子上(体系是0.2 M盐浓度,pH 9.0)。


应用实例:

高效去除人体DNA (99.99%)干扰、快速检测下呼吸道感染(LRIs)病原


   呼吸道感染(RIs)病原的快速检测一直是医疗中亟待解决的问题。RIs样本类型众多并且病原含量差别很大,同时带有大量的人体细胞,因此搭建一套快速、高效的样本处理系统对于通过高通量测序进行病原检测至关重要。

       2019年Nature Biotechnology文章报道了如下流程。为了尽可能去除宿主DNA、提高检测灵敏度,在优化实验的人体宿主细胞去除、微生物DNA提取和nanopore测序等三个步骤都做了对应的优化,比如宿主DNA去除时找到了合适浓度的saponin(2.2%),HL-SAN步骤由两步减为一步,清洗步骤缩减为2次。最终,从拿到样本到建库完成缩短至6hr,且在最终检测中达到了96.6%的敏感性和100%的特异性。

HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶

Figure 4. Nanopore宏基因组快检流程。


酶学特征

 

来源:Pichia pastoris

酶比活:≥1.75 x 10^5 Units/mg

酶活定义:在37℃,25mM Tris-HCl,pH8.5 (25℃),5mM MgCl2,500mM NaCl反应体系中,一个单位的HL-SAN在30分钟内消化50 µg/ml的小牛胸腺DNA(Sigma, D-1501),产生OD260nm处1A的吸光值变化。

特异性:非特异性内切核酸酶,能够将单链及双链的DNA及RNA,消化成5个碱基为主的寡核苷酸oligos。

酶活条件:(Effective是指活性在最优活性10%以上的条件范围)

Condition

Optimal

Effective

Mg2+

5-20 mM

1-40 mM

pH

9.0

7.0-9.5

Temperature

35 ℃

4-50 ℃

NaCl

500 mM

50 mM -1 M


References

Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection. Charalampous T, Kay GL, Richardson H, Aydin A, Baldan R., Jeanes C, Rae D, Grundy S, Turner DJ, Wain J, Leggett RM, Livermore DM, O’Grady J. Nature Biotechnology. 2019; 37: 783–792. 

A Structured Workflow for Mapping Human Sin3 Histone Deacetylase Complex Interactions Using Halo-MudPIT Affinity-Purification Mass Spectrometry. Banks CAS, Thornton JL, Eubanks CG, Adams MK, Miah S, Boanca G, Liu X, Katt M, Parmely T, Florens LA, Washburn MP. Molecular & Cellular Proteomics. 2018; 17 (7): 1432-1447. 

Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida. Williamson A, Pedersen H. Protein Expr Purif. 2014; 97: 29-36.


订购信息


货号

描述

规格

浓度

储存条件

70910-202

HL-SAN 25 kU

25 kU

25 U/µl

-20 ℃

70910-150

HL-SAN 500 kU

500 kU

25 U/µl

-20 ℃

70911-202

HL-SAN Triton FREE 25 kU

25 kU

25 U/µl

-20 ℃

70911-150

HL-SAN Triton FREE 500 kU

500 kU

25 U/µl

-20 ℃


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