PCR Decontamination Kit

PCR去污染试剂

描述

          在研究和诊断中，PCR是一种检测DNA是否存在的敏感方法。PCR中使用的聚合酶经常被E.coli DNA污染。当靶向少量细菌DNA时，污染的DNA可能导致灵敏度降低和假阳性。其他污染源可能是dNTPs、缓冲体系、引物/探针，以及操作过程中引入的DNA。

       对细菌的检测和分型可以采用以16S或23S rDNA基因保守区段为靶点的广谱范围探针。该方法对细菌DNA污染非常敏感，而大多数mastermix和聚合酶中都发现细菌DNA的痕迹（Figure 1）。当使用qPCR检测或定量少量的细菌DNA时，污染的E.coli DNA可能会导致假阳性结果。

Figure 1. 多个品牌的PCR Master mix中检出E.coli 23S rDNA。反应体系是多品牌的Master mix、23S DNA探针和水（不加模板）。实验组的所有Master mix都能检出痕量的E.coli 23S DNA，Cq值介于30-35。

       为了解决这个问题，我们开发出PCR去污染试剂，既能去除mastermix中细菌DNA污染，又不影响PCR反应的灵敏度。此外，该试剂无RNase活性。

优势

1. 很容易去除PCR mastermix中的DNA污染；

2. 减少背景污染，提高目标基因检测下限；

3. 不影响PCR检测灵敏度；

4. 用于终点PCR和探针依赖的qPCR；

5. 简单易用，操作方便。

组分及特性

1. dsDNase：双链特异性DNA酶，去除mastermix、引物及探针等的污染DNA；

2. DTT：60℃条件下，能够不可逆灭活dsDNase，确保模板DNA不被清除。

使用指导

1.  将引物、探针及mastermix和PCR去污染试剂混合在一起；

2. 37℃条件下孵育20分钟；（去除DNA污染）

3.  60℃条件下孵育20分钟；（灭活dsDNase）

4.  加入模板，并运行qPCR程序。

（左图： 以20 µl反应体系为例）

不降低反应灵敏度

       DNA污染主要是高灵敏度应用面对的问题。这些应用，以低丰度DNA为目标检测基因，极易受到污染DNA的干扰。因此，任何影响qPCR灵敏度的去除DNA污染的方法，都是不能使用的。

Figure 2. 用PCR去污染试剂处理/未处理的mastermix、5个10倍梯度稀释的gDNA和水（NTC）为模板进行qPCR检测。与NTC untreated组相比，NTC decontaminated组在45个cycle仍然没有信号，说明PCR去污染试剂能最大程度去除mastermix中的污染。PCR去污染试剂处理前/后数据相比，Cq值并没有明显改变，说明基本不影响反应灵敏度。