胶原酶NB——在组织解离中的应用方法
溶组织梭状芽胞杆菌来源的胶原酶，是一种蛋白水解酶，作用机制是原位切割人或动物组织的三螺旋胶原分子。Nordmark胶原酶NB产品，特别适用于从各种组织中分离细胞，及干细胞传代。生产及质量要求严格按照药品生产质量标准进行，性能稳定、可靠的批间一致性及出色的产品性能。
GMP级别的酶
用于组织解离的酶是组织工程及器官移植的关键原料。因此，Nordmark Biochemicals提供了卓越的GMP级胶原酶NB和中性蛋白酶NB，产品的生产符合欧盟良好生产规范（GMP）。
1. 制造过程的TSE安全性已通过EDQM认证；
2. 批次内毒素水平低，并根据欧洲药典进行了不常见毒性测试；
3. 根据ICH指南进行病毒验证和稳定性研究的数据。
储存和分装
所有胶原酶NB产品均以冻干粉形式提供，可在+2至+8°C下保存。 在防潮条件下，可以保持稳定且至少一年不失去活性。 胶原酶NB产品可溶于常见的缓冲液，例如HBSS。可以将重组酶进行无菌过滤，分装并在-20°C下保存一年。 应避免反复冻融。
组织消化的方法优化
下表列出了针对不同种属、不同组织来源细胞进行分离，推荐的产品组合及使用方法。一般来说，胶原酶使用条件取决于待分离组织的类型和来源，以及组织分离步骤方法。 因此，下表的胶原酶NB浓度应视为优化参考条件，应通过监测、分析消化过程的进展，确定胶原酶的最佳使用方案。 根据Wünsch，胶原酶活性以PZ单位表示，在37°C和pH 7.4时显示最佳状态。 胶原酶需要钙才能发挥全部催化活性，建议使用2 mM Ca2+。
灭活和抑制剂
通过冷却或稀释消化液来减少消化进程。
胶原酶在高pH值下可逆失活，在低pH值下不可逆失活。 胶原酶的抑制剂是半胱氨酸，或螯合剂如EDTA。
产品优势
胶原酶NB在研究中的应用
胶原酶NB 1优质级是一种高度纯化的胶原酶，具有极低的蛋白水解活性。对于大多数应用，需要添加纯化的中性蛋白酶NB。
胶原酶NB 4标准级和胶原酶NB 4G证明级是具有均衡蛋白水解活性组合的粗纯胶原酶。
胶原酶NB 5无菌级的特点是具有与胶原酶NB 4标准级相似的酶活特性，但在无菌条件下生产（根据欧洲药典）。
胶原酶NB 8广谱纯化，包含更高的胶原酶和减少的蛋白水解活性。
符合GMP标准、符合临床要求的酶
高度纯化的胶原酶NB 1 GMP级和中性蛋白酶NB GMP级显示的酶学性质分别与胶原酶NB 1优质级和中性蛋白酶NB相似。
胶原酶NB 6 GMP级显示出与胶原酶NB 4标准等级相似的酶促性质，并且特别适合必须满足GMP要求的应用，例如组织工程，分离和专门用于移植到人类的干细胞传代。因此，在使用胶原酶NB 4标准级建立方法后，您可以轻松切换到胶原酶NB 6 GMP级。
表：针对不同种属、不同组织来源细胞进行分离，推荐的产品组合及使用方法
细胞类型 | 组织 | 物种 | 胶原酶NB | 浓度 | 实验条件 | 备注 |
腺泡细胞 | 胰腺 | 人类 | NB 8 | 0.05 – 0.1PZ U/ml | 1h,37°C |
|
脂肪细胞 | 脂肪 | 人类，小鼠 | NB 4 (NB 5 or NB 6), NB 4G | 0.2 – 0.3 PZ U/ ml * | 30 – 45 min, 37 °C |
|
羊膜细胞 | 羊膜 | 人类 | NB 8 | 3.5 – 5.5 PZ U/ml | 3 – 5 h, 37 °C |
|
心肌细胞 | 心 | 大鼠（成年） | NB 8 | 0.5 PZ U/ml | 45 – 60 min
(recirculation and digestion) | If required hyaluronidase,
pancreatin or DNAse I |
人类 | NB 8 | 0.8 – 1.0 PZ U/m | 2 – 3.5 h, 37 °C |
|
软骨细胞 | 软骨 | 小鼠（新生） | NP** and NB 4 (NB 5 or NB 6) | 1) NP: 0.5 – 1 DMC U/ml
2) NB 4: 0.3 PZ U/ml | 1) NP: 15 – 20 min, 37 °C
2) collagenase: 30 – 45 min, 37 °C | Sequential digestion steps |
人类 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.3 – 0.4 PZ U/ml | 4 – 16 h, 37 °C | If required Neutral Protease NB |
软骨细胞（关节） | 软骨 | 牛 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.2 – 0.3 PZ U/ml | 14 – 16 h, 37 °C |
|
软骨细胞（半月板） | 纤维软骨 | 牛 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.2 – 0.3 PZ U/ml | 14 – 16 h, 37 °C |
|
绒毛膜细胞 | 绒毛 | 人类 | NB 8 | 3.5 – 5.5 PZ U/ml | 3 – 5 h, 37 °C |
|
嗜铬细胞 | 肾上腺 | 牛，大鼠 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.3 – 0.5 PZ U/ml | 20 – 30 min, 37 °C |
|
子宫内膜细胞 | 子宫内膜 | 人类 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.2 – 0.3 PZ U/ml | 30 min, 37 °C |
|
内皮细胞（HDMEC） | 包皮 | 人类 | NB 4 (NB 5 or NB 6), NB 4G | 0.5 – 0.7 PZ U/ml | 0.5 – 2 h, 37 °C |
|
内皮细胞（HUVEC） | 脐带 | 人类 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.15 – 0.25 PZ U/ml | 0.5 – 2 h, 37 °C | If required hyaluronidase |
上皮细胞 | 乳腺 | 小鼠 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.34 PZ U/ml | 15 – 25 min, RT |
|
甲状腺 | 人类 | NB 4G | 0.25 – 0.3 PZ U/ml | RT | If required dispase |
成纤维细胞 | 皮肤 | 人类 | NB 4G | 0.26 PZ U/ml | 2 h, 37 °C |
|
皮肤，结缔组织 | 鼠类 | NB 4G | 0.2 – 0.5 PZ U/ml | 12 – 20 h, 37 °C |
|
肝细胞 | 肝 | 猪 | NB 8 | 0.2 – 0.3 PZ U/ml | Perfusion and subsequent digestion |
|
小鼠 | NB 4G | 0.08 – 0.11 PZ U/ml | 5 – 15 min, 37 °C
(perfusion 5 – 8 ml/min) | Total collagenase perfusion volume 90 –110 ml |
大鼠 | NB 4G | 0.12 – 0.15 PZ U/ml | 10 – 25 min, 37 °C
(perfusion 5 – 8 ml/min) | Total collagenase perfusion
volume 100 – 125 ml |
肝细胞/肝星状细胞 | 肝 | 人类 | NB 4G | 0.25 – 0.35 PZ U/ml | 10 – 20 min, 37 °C |
|
胰岛 | 胰腺 | 人类 | NB 1 and NP** | Per gram tissue:
20 PZ U (NB 1) and 0.8 – 1.5 DMC U (NP) | 15 – 30 min, 37 °C |
|
鼠类 | NB 8 | 1.5 – 1.7 PZ U/ml | 14 – 17 min, 37 °C
(perfusion and subsequent digestion) |
|
猪（成年） | NB 1 and NP** | Per gram tissue:
15 – 18 PZ U (NB 1) and 0.8 – 1.3 DMC U (NP) | 15 – 30 min, 37 °C |
|
NB 8 and NP** | Per gram tissue:
4.4 PZ U (NB 8) and 0.5 – 0.7 DMC U (NP) | 37 °C |
|
猪（新生儿） | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.17 – 0.2 PZ U/ml | 10 – 20 min, 37 °C |
|
肺细胞 | 肺 | 小鼠 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.2 PZ U/ml | 1 h, 37 °C |
|
肥大细胞 | 肠粘膜 | 人类 | NB 4G | 0.5 PZ U/ml | 1 h, 37 °C |
|
黑色素瘤细胞 | 皮肤 | 小鼠 | NB 8 | 0.12 PZ U/ml | 30 min, 37 °C |
|
肌肉细胞 | 骨骼肌 | 人类 | NB 8 | 0.4 – 0.6 PZ U/ml |
|
|
神经元 | 背根神经节 | 人类，鼠类 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.15 – 0.25 PZ U/ml | 30 – 60 min, 37 °C |
|
卵母细胞 | 卵巢 | 非洲爪蟾 | NB 4G | 0.3 – 0.5 PZ U/ml | 1.5 – 2 h, RT |
|
成骨细胞 | 骨 | 小鼠 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.15 – 0.25 PZ U/ml | 5 – 10 min, 37 °C (4 – 5 repeats)
and 0.2 % dispase | Sequential digestion steps |
人类 | NB 8 | 1.5 – 2 PZ U/ml (NB 8) and 0.25 DMC U/ml (NP) | 2 – 4 h, 37 °C |
|
许旺氏细胞 | 坐骨神经/周围神经 | 鼠类 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.2 – 0.3 PZ U/ml | 1 – 3 h, 37 °C | If required trypsin or hyaluronidase |
干细胞 | 华通氏胶 | 人类 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.13 – 0.15 PZ U/ml | 1 – 6 h, 37 °C | If required hyaluronidase 1 mg/ml |
干细胞（ADSC）/前脂肪细胞 | 脂质体 | 人类，小鼠 | NB 4 (NB 5 or NB 6), NB 4G | 0.2 – 0.3 PZ U/ml * | 30 – 60 min, 37 °C |
|
肿瘤细胞 | 乳房，子宫，甲状腺，肺 | 人类 | NB 8 | 3.5 – 5.5 PZ U/ml | 3 – 5 h, 37 °C |
|
结肠 | 人类 | NB 4G | 0.5 – 1 PZ U/ml |
|
|
干细胞传代 | 人胚胎干细胞（hESC） | 人类 | NB 4 (NB 5 or NB 6) | 0.15 PZ U/ml | 37 °C, 6 – 8 min |
|
*0,1-0,15 PZ U/ml final collagenase concentration after addition of adipose tissue ** Neutral Protease NB |