TurboNuclease


重组Serratia marcescens(粘质沙雷氏菌)的细胞外内切核酸酶。(与Benzonase由同一基因编码,Benzonase是Merck的商标,TurboNulcease是Accelagen的商标)


描述

TurboNuclease是用E.coli表达、通过专利纯化过程制得超纯级的重组粘质沙雷氏菌的细胞外内切核酸酶。TurboNuclease是高纯度的同源二聚体,由2个27kDa亚基组成,具有非常高的比活力,且无蛋白酶活性。它能把单链及双链核酸(DNA或RNA)非特异地水解成1到4个碱基的5’-单磷酸末端寡核苷酸。


应用

1. 在蛋白纯化及样品制备过程中,能够有效降低粘稠度;

2. 在病毒疫苗、病毒载体(如腺病毒、AAV等)及溶瘤病毒等制备过程中,去除核酸污染;

3. 在蛋白电泳(SDS-PAGE)、2D电泳过程中,能减少条带拖尾现象;

4. 在PBMC解冻、类器官处理中,能减少或阻止细胞聚团;

5. 在绝大多数应用中,TurboNuclease能够替代粗提的DNase I。


优势

1. 与竞品的重组粘质沙雷氏菌的细胞外内切核酸酶相比,TurboNuclease能耐受更高的盐浓度、具有更宽的最适pH范围;

2. 与Benzonase相比,TurboNuclease有更宽的适合pH范围;

3. 昆虫表达系统中,pH低于6.5,与其他核酸酶相比,TurboNuclease酶活更高;

4. 能耐受500mM盐浓度,——在500 mM NaCl条件下起作用,但酶活会有所降低。


酶活定义

在37℃,pH 8.0,50 mM Tris-HCl及1 mM MgCl2反应体系中,一个单位的TurboNuclease酶在30分钟内可将鲑鱼精子DNA消化成1.0 OD260的酸可溶寡核苷酸;等同于将50µg的鲑鱼精子DNA完全消化成寡核苷酸。TurboNuclease和Benzonase有相似的比活力。


酶活性和特异性

TurboNuclease比活力为>1.3x106 units/mg,相当于>3x106 Kunitz units/mg,是高纯度牛DNase I比活力(约为25,000 Kunitz units/mg)的100倍以上。

TurboNuclease无可检测的蛋白酶活性。


组分及参数

TurboNuclease保存液是50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2,及50% Glycerol。

通过Accelagen的专利纯化工艺制得,纯度达到99%以上;

内毒素<0.1 EU/1000units,由Charles River的Endosafe PTS LAL检测得到。


储存条件

建议储存在-20℃,稳定保存2年以上。37℃条件下在保存液中至少稳定3周,而不影响活性。


使用建议

1.为了降低细胞裂解液粘稠度,建议加入10-100 U/g细胞量,4℃孵育10-30分钟; 

2.在AAV纯化过程中,推荐 5 – 50 U/ml的酶用量,37℃孵育1-2小时。

缓冲体系、细胞类型及细胞裂解方法等,都会影响最终的消化效果。TurboNuclease比活力极高,细胞裂解液中低于1µl /ml的用量,并不影响任何下游实验。

TurboNuclease内切核酸酶


                                                                                                                           TurboNuclease内切核酸酶

Figure 1. 37℃条件下,50 µg的鲑鱼精子DNA与指定量的                                                      Figure 2. 通过Accelagen的专利纯化工艺制的

TurboNuclease和竞品的粘质沙雷氏菌内切酶孵育30分钟,                                                          TurboNuclease,纯度达到99%以上。

EtBr染色。孵育体系是50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM MgCl2。

货号

描述

规格

储存条件

运输条件

N0103M

TurboNuclease, ultrapure, non-sterile

50,000 units

-20℃

2-8℃

N0103L

TurboNuclease, ultrapure, non-sterile

250,000 units

-20℃

2-8℃

N0103G

TurboNuclease, ultrapure, sterile

1,000,000 units

-20℃

Dry Ice


Q&A

【Q1】怎么灭活TurboNuclease?如何去除TurboNuclease?

【A1】TurboNuclease活性状态需要Mg离子,EDTA及其他能去除Mg或Mn的金属螯合剂都能抑制TurboNuclease。TurboNuclease能耐受苛刻条件,比大多数蛋白都要稳定。目前,没有特异的方法去除TurboNuclease。AAV或蛋白下游纯化用的大部分色谱柱都不会吸附TurboNuclease。

【Q2】需要更换缓冲体系时,为了保持TurboNuclease的活性,必需哪些条件?

【A2】TurboNuclease活性状态需要Mg离子。TurboNuclease保存液中的Mg足以保持酶活,额外添加1-2mM Mg离子会增强酶活。

【Q3】TurboNuclease能跟蛋白酶抑制剂联用吗?

【A3】可以,蛋白酶抑制剂一般不影响TurboNuclease的活性。由于很多蛋白酶抑制剂中含有EDTA,会影响TurboNuclease活性。

【Q4】目标蛋白不可溶,需要在变性条件下做纯化。那么,TurboNuclease能够在尿素或盐酸胍环境下起作用吗?

【A4】在高浓度的尿素或盐酸胍条件下,TurboNuclease会变性,并不起作用。

【Q5】TurboNuclease跟其他核酸酶相比,有哪些优势?

【A5】与Benzonase及许多核酸酶等一样,TurboNuclease也偏好低离子浓度、有最适pH范围。相比其他竞品的重组粘质沙雷氏菌的细胞外内切核酸酶产品,TurboNuclease能耐受更高的盐浓度、具有更宽的最适pH范围。与Benzonase相比,TurboNuclease有更宽的适合pH范围。同时,TurboNuclease能在500 mM NaCl条件下起作用,但酶活会有所降低。


AAV纯化相关文献——

Karina Kawka et al, (2021) Integrated development of enzymatic DNA digestion and membrane chromatography processes for the purification of therapeutic adenoviruses. Separation and Purification Technology. 254

Neil G.Rumachik et al, (2020) Methods Matter: Standard Production Platforms for Recombinant AAV Produce Chemically and Functionally Distinct Vectors. Molecular Therapy. 18: 98-118

April R.Giles et al, (2018) Deamidation of Amino Acids on the Surface of Adeno-Associated Virus Capsids Leads to Charge Heterogeneity and Altered Vector Function. Molecular Therapy 26: 2848-2862

Wang Q et al, (2015) Identification of an adeno-associated virus binding epitope for AVB sepharose affinity resin. Mol Ther. 2: 15040

Cecchini S et al, (2011) Reproducible High Yields of Recombinant Adeno-Associated Virus Produced Using Invertebrate Cells in 0.02- to 200-Liter Cultures. Human Gene Therapy 22:1021–1030

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