常见问题 Q&A

1.      什么是胶原酶？

胶原蛋白是源自于一种组织溶梭菌的革兰氏阳性细菌的金属蛋白酶。 梭菌胶原酶分为两类，分别是I类胶原酶和II类胶原酶。 它们是通过表达各自的基因colG和colH表达生成的。

胶原酶原位切割人类或动物组织的三螺旋胶原分子中的肽键。 这两类对胶原蛋白分子的活性不同。 假定I类胶原酶将完整的胶原螺旋裂解为较小的肽，这些小肽正好是II类胶原酶的底物，因此，这两种类在胶原的有效消化中起协同作用。 所有胶原酶NB产品均包含两种胶原酶类别。

2.     什么是中性蛋白酶？

中性蛋白酶是来源于革兰氏阳性细菌组织溶梭菌的蛋白酶。 它通常与胶原酶结合用于组织解离。

3.     Nordmark胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品之间有什么区别？

Nordmark的产品组合包括几种胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品，可以根据其纯化水平（未纯化，纯化，高度纯化）和应用领域（研究，临床）进行区分。

胶原酶NB 4标准级（目录号S1745401）和胶原酶NB 4G证明级（目录号S1746501）包含均衡的蛋白水解活性组合。与胶原酶NB 4标准级（≥0.10 PZ U / mg）相比，胶原酶NB 4G证明级具有更高的胶原酶活性（≥0.18 PZ U / mg）。蛋白水解副反应活性也相应增加。

胶原酶NB 5无菌等级（目录号N0002779）和胶原酶NB 6 GMP等级（目录号N0002779）显示出与胶原酶NB 4标准级相当的酶学性质，胶原酶活性≥0.10 PZ U / mg，且有一个良好的蛋白水解副反应平衡状态。胶原酶NB 5按照欧洲药典标准的无菌等级。

胶原酶NB 6 GMP等级是根据cGMP准则生产的，并且符合欧盟药典。

胶原酶NB 8广谱酶（目录号S1745601）是一种纯化的胶原酶。因此，它具有更高的胶原酶活性（≥0.9 PZ U / mg）和较低的蛋白水解副反应活性。

胶原酶NB 1优质级（目录号S1745503）和胶原酶NB 1 GMP级（目录号N0002937）是高度纯化的胶原酶。它们显示出较高的胶原酶活性（≥3.0 PZ U / mg），并且副反应活性几乎完全没有。这两个酶的活性大致相同，但胶原酶NB 1 GMP级是根据GMP准则生产的。

中性蛋白酶NB（目录号S3030111）和中性蛋白酶NB GMP级（目录号N0002936）也具有大致相同的酶活性，且活性≥0.5 DMC U / mg。但中性蛋白酶NB GMP级是根据GMP准则生产的。

中性蛋白酶NB高活性级（目录号S3030202）是经过高度纯化的，因此具有较高的活性（≥5.0 DMC U / mg）。但它不适用于GMP等级。

4.     胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品的起源是什么？

所有Nordmark胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品均来源于组织溶梭菌。 溶组织梭状芽胞杆菌是一种厌氧的革兰氏阳性细菌，它天然的就会产生胶原酶和中性蛋白酶。

5.     胶原酶NB 1和中性蛋白酶NB是否无菌？

胶原酶NB 1 GMP级（目录号N0002937），胶原酶NB 1优质级（目录号S1745503），中性蛋白酶NB GMP级（目录号N0003553），中性蛋白酶NB（目录号S3030111）和性蛋白酶NB高活性级（目录号S3030202）在生产冻干之前会使用0.2 µm滤芯进行过滤，但不是无菌条件下生产的。 因此，根据欧洲药典他们不是无菌的。

对于胶原酶NB 1 GMP级和中性蛋白酶NB GMP级，会进行微生物检验。 每个批次的COA上会显示检验结果，包括梭菌数，总需氧微生物数（TAMC）和总酵母/霉菌总数（TYMC）。

Nordmark胶原酶NB 6 GMP级（目录号N0002779）和胶原酶NB 5无菌级（目录号N0002778）是符合欧洲药典的无菌标准的。

所有其他胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品都不是无菌的。

6.     根据欧洲药典，哪些产品是无菌的？

Nordmark胶原酶NB 6 GMP级（目录号N0002779）和胶原酶NB 5无菌级（目录号N0002778）是符合欧洲药典的无菌标准的。

7.     为什么胶原酶NB 1和中性蛋白酶NB是根据酶的活性来做标准来灌装的，而为什么所有其他胶原酶NB产品根据质量作为标准来灌装的？

胶原酶NB 1和中性蛋白酶NB非常适用于从人胰腺中分离出Langerhans胰岛。 这些酶的包装大小是专门为消化一种人类胰腺而设计的。

由于其他胶原酶NB产品适用于各种应用，因此不需要特殊的包装尺寸。               

运输，库存和存储解决方案

8.     我应如何储存胶原酶NB和中性蛋白酶NB？

Nordmark胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品以冻干粉形式提供。 它们应在干燥环境中保存在+2到+8°C（如果没有在COA中另外说明）。 在这种情况下，产品一直稳定到COA上规定的有效期限。 应避免重复打开和关闭小瓶。

有关储备溶液的存储，请参阅问题11。

9.       胶原酶NB和中性蛋白酶NB的稳定性如何？

厂家科研确保胶原酶NB和中性蛋白酶的稳定性，直到COA上规定的有效期为止。 为确保性能稳定，非GMP等级的产品会定期进行重新测试，并且根据结果可能会延长有效期。

有关GMP级产品的稳定性数据，请参阅问题30。

10.     在哪里可以找到胶原酶NB或中性蛋白酶NB的失效日期？

每个胶原酶NB或中性蛋白酶NB都会随附一份COA，其中注明了该产品的失效日期。产品的标签上还标明了胶原酶NB 1 GMP级，中性蛋白酶NB GMP级和胶原酶NB 6 GMP级的有效期。如果您想获得特定批次的COA，请与上海倍笃生物科技有限公司联系。http://www.bestobio.com/

11.     我应该每次使用胶原酶NB前配制成储备液并分装吗？

我们建议通过将胶原酶NB溶解在适当体积的缓冲液（例如HBSS，PBS，Tris或Ringer溶液）中制成储备溶液。 配制好的酶应进行无菌过滤（如果不是无菌的话），分装并保存在-20°C下。 我们的稳定性研究表明，如果避免反复冷冻和解冻，该酶在这些条件下可以维持稳定一年。

如果将小瓶打开和关闭几次，冻干的酶就会与空气中的水分接触，这可能会降低其活性。

12.     我可以使用过滤的方法来配制胶原酶NB和中性蛋白酶NB无菌溶液吗？

是的，可以使用0.22 µm滤芯进行过滤。 我们建议使用蛋白质结合性能低的过滤器（例如醋酸纤维素，PVDF或PES）。

13.     将胶原酶溶液添加到细胞中之前，应如何保存？

胶原酶NB和中性蛋白酶NB溶液应始终保存在冰上直至其使用，因为如果在较高温度下保存，其活性会大大降低。 通常，溶液应该尽可能快的用完。

14.     胶原酶和中性蛋白酶活性的最佳温度是多少？

胶原酶和中性蛋白酶的活性在37°C时处于最佳状态。

15.     胶原酶活性的最佳pH是多少？

在pH 7.4时，胶原酶活性处于最佳状态。

16.     中性蛋白酶活性的最佳pH是多少？

中性蛋白酶活性在中性pH范围内处于最佳状态。

17.     如果胶原酶NB或中性蛋白酶NB与空气中的水分接触会怎样？

这是非常重要的，必须保护酶避免其受到空气中水分的损伤。 胶原酶和中性蛋白酶都是吸湿性; 因此，请勿重复打开和关闭小瓶。

如果这些酶与水分接触他们可能会由于自身消化而失去活性。

如果一瓶酶不能一次性使用完，建议制备储备溶液并储存在-20℃下。 欲了解更多信息，请参阅Q 11。

18.     如果胶原酶NB或中性蛋白酶NB在运输过程中温度上升怎么办？

胶原蛋白NB 1 GMP级和中性蛋白酶NB GMP级可以使用冰袋或干冰运输，具体取决于目的地。 胶原酶NB 1 GMP级在25°C下可稳定2个月，在40°C下可稳定7天。 中性蛋白酶NB GMP级在25°C下可稳定6个月，在40°C下可稳定7天。 随产品一起提供的是温度示踪剂。 示踪剂可以显示酶是否暴露在37°C或更高的温度下。

胶原酶NB 6 GMP级在室温下运输。 对于胶原酶NB 6 GMP级，我们的数据表明它在25°C下可稳定3年，在40°C下可稳定4.8个月。

对于Nordmark 的GMP产品，根据ICH指南进行了稳定性研究。 有关更多信息，请参阅问题31。如果您想获取更多信息，请与我们联系，http://www.bestobio.com/ ，包括所有其他Nordmark Collagenase NB和Neutral Protease NB产品的稳定性数据。

细胞分离应用

19.     我可以在哪些实验应用上使用Nordmark胶原酶NB？

Nordmark胶原酶NB产品可用于从含有胶原蛋白的所有人类或动物组织中分离细胞。可以显示出具有高产率活细胞的有效细胞分离，例如用于胰腺，脂肪组织，软骨，肝，肺，胎盘，心脏和许多其他组织类型。由于胶原酶既可用于研究应用，也可用于临床领域，因此Nordmark提供的胶原酶NB产品分别为研究级和GMP级。

Nordmark胶原酶NB产品有不同的纯化水平。胶原酶NB 4标准级，胶原酶NB 5无菌级，胶原酶NB 6 GMP等级和胶原酶NB 4G广域级是未经纯化的等级，其中包含胶原蛋白水解和其他蛋白水解活性（例如中性蛋白酶和梭菌蛋白酶）的平衡混合物。这些副反应活活性是有效消化许多组织类型（例如脂肪组织，软骨或肝脏）所必需的。

对于某些应用，例如从啮齿动物胰腺中分离出朗格汉斯的胰岛，需要具有更高的胶原蛋白水解活性和降低的副反应活性的胶原酶。对于这些应用，建议使用纯化的胶原酶NB 8广域级。

为了分离人类胰岛，Nordmark提供了高纯度的胶原酶NB 1和中性蛋白酶NB作为GMP和非GMP等级。

有关应用程序的更多信息，请访问我们的主页http://www.bestobio.com/或与我们联系。

20.     为什么胶原酶NB 1和中性蛋白酶NB作为两种单独的酶提供？

由于有效的组织离解需要蛋白水解活性，因此胶原酶NB 1通常与中性蛋白酶NB结合使用。 两种酶特别适用于分离人的胰岛。 由于分离所需的两种酶的浓度取决于例如供体的年龄以及器官的重量和状况，两种酶的供应分别允许根据这些变量进行单独给药。

21.    Nordmark的细胞分离方法在我的实验室中不起作用。 我应该怎么办？

所需的胶原酶浓度取决于组织类型和来源以及分离程序。 因此，应将细胞分离方案中规定的胶原酶NB浓度视为起点。

您可以增加或减少消化时间或增加或降低胶原酶NB浓度。 为了确定最佳条件，应目视监测消化过程的进度。

22.    我应该使用哪种缓冲液进行细胞分离？

我们没有特别建议使用的缓冲液，因为我们知道好几种缓冲液（包括PBS，Tris和HBSS）都可用于胶原酶的细胞分离。

胶原酶取决于钙离子，因此建议使用Ca ²⁺离子≥2 mM的缓冲液。 胶原酶被EDTA抑制，因此缓冲液中绝对不应包含钙螯合剂（例如EDTA）（请参阅问题25）。

23.    如何停止消化过程？

可以通过降温，添加人或胎牛血清，稀释或从消化液中冲洗来减少消化进程。 由于存在几种方法，因此没有一般性建议，它也取决于组织和细胞的类型及应用。

24.    有胶原酶的抑制剂或活化剂吗？

由于胶原酶和某些次级蛋白酶依赖钙，因此建议使用Ca ²⁺离子≥2 mM的缓冲液。绝对不应该存在钙螯合剂（例如EDTA）。

胶原酶在高pH值下可逆失活，在低pH值下不可逆失活。 胶原酶的抑制剂包括半胱氨酸或诸如EDTA的螯合剂。

符合GMP的胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品

25.    GMP代表什么？

GMP代表良好制造规范。 良好的生产规范是有助于确保产品质量的生产和测试规范。 许多机构要求按照GMP准则生产药品和医疗器械。

这些准则包含对成分的可追溯性，制造，质量控制和保证，包装，存储和分配的要求。

26.    谁是Nordmark胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品的制造商？

Nordmark胶原酶NB和Neutral蛋白酶NB的所有产品均由德国制药公司Nordmark Pharma GmbH生产。

由合格的员工在专用生产设备中使用经过验证和校准的设备来进行生产。 这确保了产品始终如一的高质量和安全性。

Nordmark还生产胶原酶，用作伤口愈合最终药物产品中的活性成分。 德国当局已授予Nordmark药品制造许可证。 根据德国《药品法》第13条第1款（Arzneimittelgesetz-AMG），已获准生产动物和微生物来源的活性成分。

27.    如何测试Nordmark GMP产品是否适用于我的应用方案？

为了测试胶原酶NB 6 GMP级（目录号N0002779）并建立使用方法，我们建议应用胶原酶NB 4标准级（目录号S1745401）。 该非GMP品级具有比胶原酶NB 6 GMP级更高的酶性能，且价格更优惠。 建立使用方法后，可以在不更改使用方法的情况下从胶原酶NB 4标准级轻松转换为胶原酶NB 6 GMP级。

从胶原酶NB 1优质级（目录号S1745503）和中性蛋白酶NB（目录号S3030111）转移到胶原酶NB 1 GMP级别（目录号N0002937）和中性蛋白酶NB GMP级别的方法相同（目录号N0003553）。

28.    胶原酶NB和中性蛋白酶NB是否被视为TSE（传染性海绵状脑病）安全？

是的，Nordmark胶原酶NB和中性蛋白酶NB被视为TSE安全。

对于符合GMP的胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品，原材料的安全性已获得欧洲药品质量局（EDQM）的“传染性海绵状脑病-欧洲药典证书”（TSE-CEP）的认证。

根据要求，制造商Nordmark会发出访问信，该信允许使用TSE-CEP证书向主管机关进行归档。 GMP产品的客户也可以使用Nordmark发布的TSE风险声明。

对于非GMP级胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品，可应Nordmark的要求获得原产地证书。 原产地证书规定产品不包含也不来自特定的风险材料。

29.    GMP级胶原酶NB和中性蛋白酶NB在不同温度下的稳定性如何？

对于胶原酶NB 1 GMP级，中性蛋白酶NB GMP级和胶原酶NB 6 GMP级，制造商Nordmark根据ICH指南进行了稳定性研究。 根据要求，这些研究的摘要报告可提供给GMP产品的客户。

冻干粉的稳定性研究在以下条件下进行：

30.    GMP级产品可使用哪些文件？

对于胶原酶NB 1 GMP等级，胶原酶NB 6 GMP级或中性蛋白酶NB GMP级的客户，可根据要求提供以下文件：

分析证书

Nordmark的GMP证书

胶原酶生产许可证

EDQM TSE安全证书（TSE-CEP）

病毒安全性研究摘要

稳定性摘要报告

附加信息

31.    我使用了其他供应商的胶原酶。 现在，我要使用Nordmark胶原酶NB。 如何选择合适的产品？

由于每个胶原酶制造商都有自己的生产和纯化工艺，因此很难比较不同供应商的胶原酶产品。 此外，供应商以不同单位说明胶原酶的活性（请参阅问题36）。

一种选择是根据应用选择合适的Nordmark胶原酶NB产品。 有关推荐产品和应用数据的信息，请访问我们的主页或与我们联系。

另一种选择是将以前使用的胶原酶的活性单位转换为PZ单位（请参阅问题35）。

32.    PZ（胶原酶活性）的单位定义是什么？

根据Wuensch，Nordmark胶原酶NB产品的活性以PZ单位表示。

1 PZ U在25°C，pH 7.1下每分钟催化1 µmol 4-phenylazobenzyl- oxycarbonyl-L-prolyl-L-leucyl-glycyl-L-prolyl-D-arginine (PZ)

（Wünsch，E.＆Heidrich，H.G.（1963）Hoppe-Seyler的Z. Physiol。Chem。333，149-51）。

33.    如何将其他供应商的酶活单位转换为PZ单位，反之亦然？

胶原酶活性通常以PZ单位（根据Wuensch），胶原消化单位（CDU，也称为Mandl单位）或FALGPA单位表示。 没有确切的转换因子，但是可以应用以下近似转换因子：

1 PZ U〜3.9 FALGPA U

1 PZ U〜1000 Mandl U或CDU

此外，供应商提供不同纯化水平的胶原酶，这使得比较来自不同供应商的胶原酶更加困难。 一种选择是根据应用选择合适的胶原酶NB产品和浓度。 有关推荐产品和应用数据的信息，请访问我们的主页或与我们联系。

34.    DMC U（中性蛋白酶活性）的定义是什么？

1个DMC单元是在25°C，pH 7.0下每分钟催化从二甲基酪蛋白（DMC）裂解1 µmol肽键，形成新的末端氨基，用TNBS测定

(Lin, Y.-C. et al. (1969) J. Biol. Chem. 244, 789-93).

35.    Nordmark的产品是否经过支原体测试？

没有，Nordmark胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品没有做过支原体测试。

36.    您的产品是否经过内毒素测试？

内毒素是脂多糖，是革兰氏阴性细菌外细胞膜的主要成分。

目前已确定测试以下产品的内毒素：

胶原酶NB 1 GMP级（目录号N0002937）

胶原酶NB 1优质级（目录号S1745503）

胶原酶NB 6 GMP级（目录号N0002779）

胶原酶NB 8广谱级（目录号S1745601）

中性蛋白酶NB GMP级（目录号N0003553）

中性蛋白酶NB高活性级（目录号S3030202）

37.    什么是COA？

COA是每批胶原酶NB和中性蛋白酶NB随附的针对特定批次的文档。 在分析证书上注明了批次特异性数据，例如胶原酶活性和保质期。

此外，对于符合GMP的胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品，COA是根据客户签发的（100毫克包装的胶原酶NB 6 GMP级包装除外）。

38.    我可以直接在人体内使用胶原酶NB或中性蛋白酶NB产品吗？

Nordmark胶原酶NB和中性蛋白酶NB产品不适合直接用于人类，例如用于注射剂或软膏剂。